El análisis HPLC es una técnica de laboratorio que separa los componentes de una muestra líquida haciéndolos pasar, impulsados por una fase móvil a presión, a través de una columna rellena de una fase estacionaria. Un detector registra cada componente a medida que sale de la columna y genera un cromatograma, a partir del cual pueden identificarse y cuantificarse sustancias con un método validado.
¿Qué es un análisis HPLC?
HPLC son las siglas en inglés de high-performance liquid chromatography, es decir, cromatografía líquida de alta resolución. Pertenece a la familia de las técnicas de separación cromatográfica, que la Farmacopea Europea agrupa en su capítulo general 2.2.46 junto a la cromatografía de gases y otras modalidades. Ese capítulo define las magnitudes cromatográficas y los requisitos de idoneidad del sistema para procedimientos de cromatografía líquida y de gases (EDQM, 2022 (se abre en una pestaña nueva)).
El principio es la retención diferencial: cada compuesto interacciona de forma distinta con ambas fases y tarda un tiempo diferente en recorrer la columna, de modo que la mezcla sale separada en bandas sucesivas.
¿Cómo funciona un equipo HPLC?
Un equipo de cromatografía HPLC es un sistema modular por el que circula la fase móvil de forma continua, en seis etapas:
- Fase móvil. Uno o varios disolventes, contenidos en reservorios, transportan la muestra a lo largo del sistema. Su composición puede ser constante (elución isocrática) o variar durante el análisis (elución en gradiente).
- Bomba. Impulsa la fase móvil con un caudal estable y a alta presión, necesaria para atravesar columnas rellenas de partículas finas.
- Inyector. Introduce un volumen definido de la muestra preparada en la corriente de fase móvil, de forma manual o con un inyector automático.
- Columna. Contiene la fase estacionaria, donde se produce la separación. Suele mantenerse a temperatura controlada.
- Detector. Mide una propiedad de lo que sale de la columna, como la absorbancia ultravioleta, y la convierte en una señal eléctrica.
- Sistema de adquisición de datos. Registra la señal frente al tiempo, integra los picos y documenta el resultado.
Componentes principales de un sistema HPLC
| Componente | Función | Qué puede alterar el resultado |
|---|---|---|
| Reservorios y fase móvil | Transportar la muestra y participar en la separación | Composición, pureza o desgasificación inadecuadas |
| Bomba | Mantener un caudal constante a presión | Fluctuaciones de caudal que desplazan los tiempos de retención |
| Inyector | Introducir un volumen reproducible de muestra | Volumen inyectado variable o arrastre entre muestras |
| Columna | Separar los componentes | Deterioro de la fase estacionaria o temperatura inestable |
| Detector | Generar una señal proporcional a la cantidad de analito | Respuesta no lineal o compuestos que no detecta |
| Sistema de datos | Registrar e integrar la señal | Integración incorrecta de picos solapados |
¿Qué información proporciona un análisis HPLC?
Un análisis HPLC puede aportar cuatro tipos de información, que conviene no confundir:
- Separación: muestra cuántos componentes detectables hay en la muestra y si están bien resueltos entre sí.
- Identificación: sugiere qué compuesto es cada pico, normalmente comparando su tiempo de retención con el de un patrón de referencia analizado en las mismas condiciones.
- Cuantificación: estima cuánto hay de un compuesto a partir de la respuesta del detector y de una calibración con patrones de concentración conocida.
- Perfil de impurezas: picos adicionales que el detector sea capaz de ver.
La identificación por tiempo de retención es indirecta: dos compuestos distintos pueden coincidir. Por eso, cuando se necesita una identificación inequívoca, el análisis HPLC se combina con detectores más específicos, como la espectrometría de masas.
¿Qué es un cromatograma y cómo se interpreta?
Un cromatograma HPLC es la gráfica que representa la respuesta del detector frente al tiempo. Cada compuesto detectado aparece como un pico sobre la línea base.
- Tiempo de retención: tiempo que transcurre desde la inyección hasta el máximo del pico. Es característico de un compuesto en unas condiciones concretas de columna, fase móvil, caudal y temperatura.
- Altura y área del pico: ambas guardan relación con la cantidad de compuesto que llega al detector. El área es la medida más empleada para cuantificar.
- Resolución: grado de separación entre picos vecinos; si se solapan, la integración pierde exactitud.
El área de un pico no es por sí misma una concentración. Para convertirla en una cantidad hace falta un procedimiento de calibración: analizar patrones de concentración conocida, establecer la relación entre respuesta y concentración y comprobar que esa relación es válida en el intervalo de trabajo.
Diferencias entre HPLC-UV, LC-MS y GC-MS
La elección de la técnica depende de las propiedades del compuesto y de la pregunta analítica.
| Técnica | Principio general | Detección | Aplicaciones habituales | Limitaciones |
|---|---|---|---|---|
| HPLC-UV | Separación en fase líquida | Absorbancia ultravioleta | Cuantificación de principios activos con cromóforo | Identificación limitada; no detecta compuestos sin absorción UV |
| LC-MS | Separación en fase líquida | Relación masa/carga de los iones | Identificación y cuantificación específicas | Mayor coste; efectos de matriz sobre la ionización |
| GC-MS | Separación en fase gaseosa | Relación masa/carga de los iones | Compuestos volátiles o derivatizados; cribado | Requiere volatilidad o derivatización previa |
En el análisis de esteroides, una revisión de Shackleton, Pozo y Marcos señala que la cromatografía de gases exige derivatizar los compuestos para mejorar su volatilidad y estabilidad, mientras que la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem evita ese paso y acorta los tiempos de análisis (Shackleton et al., 2018 (se abre en una pestaña nueva)).
Aplicaciones del HPLC en el análisis de sustancias
La cromatografía HPLC es una de las técnicas de análisis de laboratorio más extendidas en el control de calidad farmacéutico. En el análisis de sustancias se emplea para la cuantificación de principios activos, la detección de impurezas y productos de degradación, los estudios de estabilidad y la uniformidad de contenido entre unidades.
En el ámbito documental, un análisis HPLC permite comparar la cantidad medida con la declarada en el etiquetado. Esa comparación es la base para entender la concentración de anabolizantes y su variabilidad en productos fuera de los canales regulados.
Exactitud, precisión e incertidumbre analítica
Tres conceptos determinan cuánto valor tiene un resultado:
- Exactitud: proximidad entre el valor medido y el valor verdadero o de referencia.
- Precisión: grado de concordancia entre mediciones repetidas de la misma muestra; puede ser buena aunque el método sea inexacto.
- Incertidumbre: intervalo dentro del cual se encuentra razonablemente el valor verdadero, que debe acompañar a todo resultado cuantitativo.
La guía ICH Q2(R2), publicada por la Agencia Europea de Medicamentos (EMA), describe cómo demostrar que un procedimiento analítico es adecuado para su finalidad, como la valoración del contenido, la identificación o el control de impurezas (EMA, ICH Q2(R2) (se abre en una pestaña nueva)). La guía complementaria ICH Q14 aborda el desarrollo de esos procedimientos con criterios científicos y de riesgo (EMA, ICH Q14 (se abre en una pestaña nueva)). Un resultado solo es interpretable dentro del alcance para el que el método se ha validado.
Limitaciones del análisis HPLC
El análisis HPLC es versátil, pero no responde a todas las preguntas sobre una muestra:
- Selectividad: compuestos con tiempos de retención parecidos pueden solaparse e inflar o enmascarar un pico.
- Detección: un detector UV no ve los compuestos que no absorben a la longitud de onda elegida, por lo que su ausencia en el cromatograma no demuestra que no existan.
- Preparación analítica: la extracción y la dilución de la muestra condicionan el resultado.
- Validación: sin un método validado para esa matriz y ese intervalo, la cifra obtenida carece de respaldo.
- Alcance: un resultado de contenido no informa sobre esterilidad, contaminación microbiológica ni seguridad de uso.
Relación entre el análisis HPLC y los resultados documentales de PHARMAESTUDIO
La metodología de PHARMAESTUDIO establece que cada resultado debe documentar la técnica analítica, la incertidumbre y el alcance del ensayo, y que solo se comparan resultados obtenidos con técnicas de alcance compatible. Los protocolos documentales detallan la información que debe acompañar a un informe, y la página de laboratorios de análisis recoge los centros considerados. La técnica empleada en cada caso es la que conste en su informe; este artículo no atribuye a ningún resultado publicado un método que no figure en su documentación.
Conclusiones
El análisis HPLC separa los componentes de una muestra y, con la calibración y la validación adecuadas, permite cuantificar principios activos con exactitud y precisión conocidas. Su información depende del detector, de la preparación de la muestra y del alcance del método. Identificar un compuesto y cuantificarlo son operaciones distintas, y cualquier resultado debe leerse junto con su incertidumbre y sus limitaciones.
Preguntas frecuentes sobre el análisis HPLC
¿Qué mide exactamente un análisis HPLC?
Un análisis HPLC mide la respuesta de un detector a los compuestos que salen de la columna a lo largo del tiempo. Con patrones y calibración, esa respuesta permite identificar compuestos y estimar su cantidad.
¿El análisis HPLC sirve para identificar una sustancia con certeza?
No siempre: con detección UV, la identificación se basa en el tiempo de retención y puede no ser inequívoca. Para una identificación más específica se combina con espectrometría de masas u otras técnicas complementarias.
¿Qué diferencia hay entre HPLC-UV y LC-MS?
Ambas separan en fase líquida, pero HPLC-UV mide la absorción ultravioleta y LC-MS la relación masa/carga de los iones, lo que aporta más especificidad.
¿Un cromatograma sin picos adicionales indica que la muestra no tiene impurezas?
No, solo indica que el método no ha detectado otros compuestos. Las sustancias que el detector no ve o que coeluyen con otro pico pueden no aparecer en el cromatograma.
¿Por qué es importante que el método esté validado?
Porque la validación demuestra que el procedimiento es adecuado para su finalidad. Sin ella no se conocen su exactitud, su precisión ni su intervalo de trabajo, y el resultado de un análisis HPLC no puede interpretarse con rigor.
Fuentes consultadas
- General chapter 2.2.46. Chromatographic separation techniques now published in Ph. Eur. 11th Edition (se abre en una pestaña nueva). European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (EDQM), 2022. Consultado el .
- ICH Q2(R2) Validation of analytical procedures - Scientific guideline (se abre en una pestaña nueva). Agencia Europea de Medicamentos (EMA). Consultado el .
- ICH Q14 Analytical procedure development - Scientific guideline (se abre en una pestaña nueva). Agencia Europea de Medicamentos (EMA). Consultado el .
- GC/MS in Recent Years Has Defined the Normal and Clinically Disordered Steroidome: Will It Soon Be Surpassed by LC/Tandem MS in This Role? (se abre en una pestaña nueva). Shackleton C., Pozo O. J., Marcos J. Journal of the Endocrine Society, 2018 (doi:10.1210/js.2018-00135). Consultado el .
